土鳖虫(地鳖)配方颗粒的特异性PCR鉴别研究

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　　摘要：目的 建立基于SNP位点的特异性PCR技术，用于土鳖虫(地鳖)配方颗粒及其混伪品的分子鉴定。方法 分析土鳖虫与其常见伪品的细胞色素C氧化酶亚基1(COⅠ)序列，筛选土鳖虫SNP变异位点，设计特异性引物TBC-F(5’-TTCTTGTTGGCAAGCAGTATAAT-3’)和TBC-R(5’-AACTACTGCTCAAACAAATAATGGA-3’)。采用三步法进行聚合酶链式反应(PCR)，优化确立最佳反应体系，通过一代测序验证试验结果准确性。结果 当退火温度为55~57℃、循环数为37次时，21批土鳖虫药材、20批标准汤剂及19批配方颗粒经PCR扩增和凝胶电泳检测，均在237bp处出现单一明亮的特异性条带，伪品无条带，试验结果与一代测序结果一致。结论 建立的特异性PCR鉴别方法可准确鉴别土鳖虫药材、标准汤剂冻干粉及配方颗粒成品，为土鳖虫配方颗粒质量标准研究提供参考依据。

　　论文《土鳖虫(地鳖)配方颗粒的特异性PCR鉴别研究》发表在《药物分析杂志》，版权归《药物分析杂志》所有。本文来自网络平台，仅供参考。

　　关键词：土鳖虫(地鳖);配方颗粒;细胞色素C氧化酶亚基1基因;混伪品;特异性聚合酶链式反应;分子鉴别

　　Abstract：Objective To establish a specific polymerase chain reaction (PCR) method based on SNP loci for molecular identification of Eupolyphaga Steleophaga formula granules and its counterfeits. Methods By analyzing the cytochrome oxidase Ⅰ (COⅠ) sequences of Eupolyphaga Steleophaga and its common forgeries, the SNP mutation sites of Eupolyphaga Steleophaga were identified, and specific primers TBC-F (5’-TTCTTGTTGGCAAGCAGTATAAT-3’) and TBC-R (5’-AACTACTGCTCAAACAAATAATGGA-3’) were designed. Three-step PCR was used, and the optimal reaction system was determined by optimizing the PCR procedure. To ensure the accuracy of test results, the PCR amplified products were subjected to Sanger sequencing. Results Under the conditions of annealing temperature 55-57℃ and 37 cycles, 21 batches of Eupolyphaga Steleophaga medicinal materials, 20 batches of standard decoction and 19 batches of its formula granules showed a single specific band at 237bp after PCR amplification and gel electrophoresis, while no band was observed for adulterants or negative control. The experimental results were consistent with Sanger sequencing results, confirming the samples as Eupolyphaga sinensis. Conclusion The established specific PCR method can accurately identify Eupolyphaga Steleophaga medicinal materials, standard decoction freeze-dried powder and formula granule finished products, providing a reference for the research on quality standards of Eupolyphaga Steleophaga formula granules.

　　Keywords：Eupolyphaga Steleophaga (Eupolyphaga sinensis); formula granules; COⅠ gene; adulterants; specific PCR; molecular identification

　　1 引言

　　土鳖虫为鳖蠊科昆虫地鳖(Eupolyphaga sinensis Walker)或冀地鳖(Steleophaga plancyi (Boleny))的雌虫干燥体[1]，始载于《神农本草经》并列为中品，历代医书均有记载。其药用功效为破血逐瘀、续筋接骨，常用于跌打损伤、筋伤骨折、血瘀经闭、产后瘀阻腹痛、癥瘕痞块等病症[2-4]。现代医学研究表明，土鳖虫富含多种氨基酸、不饱和脂肪酸、黄酮和生物碱等活性物质，具有抑制血管生成、抗肿瘤、抗凝血、抗血栓、抗氧化、促进骨骼愈合等作用[5-9]。

　　土鳖虫资源包括野生和家种，以地鳖为主要来源。国内虽已形成稳定的规范化养殖体系，但随着药用需求量日益增加[10-11]，金边土鳖、美洲大蠊、金边龙虱等伪品逐渐充斥市场，影响临床用药安全与有效性，亟需建立有效的鉴别方法[12-14]。

　　目前土鳖虫的鉴别方法主要有性状鉴别[15]、理化鉴别[16]、显微鉴别[17]及分子鉴别[18-19]。前三种方法易受鉴别人员主观因素(如从业经验)干扰，且土鳖虫经煎煮、浓缩等工艺制成配方颗粒后，原有性状和显微特征消失，无法实现准确鉴别。分子鉴别具有不受主观因素影响、稳定性好、特异性高的优势，已应用于土鳖虫药材和中成药的鉴定研究。例如，李娜等[18]基于Cytb基因设计特异性引物，可鉴别土鳖虫炮制品与混伪品;刘晶晶等[19]通过比对COⅠ基因序列，建立了中成药中土鳖虫的特异性PCR鉴别方法。但针对土鳖虫配方颗粒的分子鉴别研究尚未见报道。

　　基于SNP位点的特异性PCR技术操作简便、无需测序、准确性高，已成功应用于鳖甲[20]、蜈蚣[21]、全蝎[22]等中药配方颗粒的鉴别。本研究通过筛选地鳖与其伪品的SNP位点，设计特异性引物，从DNA高度降解的样品中提取合格模板，建立土鳖虫配方颗粒的快速鉴别方法。

　　2 仪器与试药

　　2.1 试药

　　药材：27批样品购于河南、山东、江苏、安徽等地，经广东一方制药有限公司孙冬梅主任中药师鉴定，包括地鳖20批，美洲大蠊、金边土鳖、金边龙虱各2批，标本保存于该公司标本中心。

　　样品制备：将20批地鳖药材制成20批标准汤剂冻干粉和19批配方颗粒。

　　试剂：MightyAMP DNA聚合酶、TaKaRa rTaq DNA聚合酶、TaKaRa ExTaq DNA聚合酶、SpeedSTAR DNA聚合酶、DL1000 DNA Marker(购自TaKaRa公司);蛋白酶K(天根生化科技(北京)有限公司);CTAB提取液、TAE缓冲液、SDS提取液、琼脂糖(上海源叶生物科技有限公司);三氯甲烷、乙醇、异丙醇等均为分析纯;水为实验室自制超纯水。

　　2.2 仪器

　　TU-100恒温金属浴(上海一恒科学仪器有限公司)、5424R高速冷冻离心机(艾本德公司)、BioSpec-nano紫外微量分光光度计(岛津公司)、OSE-MC8微型离心机(天根生化科技(北京)有限公司)、T100 Thermal Cycler PCR仪(伯乐生命科技有限公司)、StepOnePlus MiniAmp Plus PCR仪(赛默飞世尔科技公司)、PowEase 300W PS0301电泳仪(美国伯乐生命科技有限公司)、PowerPac Basic水平电泳槽(美国伯乐生命科技有限公司)、Syngene NuGenius凝胶成像仪(Syngene公司)。

　　表1 实验药材信息

　　| 样品名称 | 基原 | 来源 | 数量 |

　　| 土鳖虫对照药材 | 地鳖(Eupolyphaga sinensis Walker) | 中国食品药品检定研究院 | 1批 |

　　| 地鳖 | 地鳖(Eupolyphaga sinensis Walker) | 河南、江苏、山东、湖北 | 20批 |

　　| 土鳖虫标准汤剂 | 地鳖(Eupolyphaga sinensis Walker) | 广东一方制药有限公司 | 20批 |

　　| 土鳖虫配方颗粒 | 地鳖(Eupolyphaga sinensis Walker) | 广东一方制药有限公司 | 19批 |

　　| 美洲大蠊 | 美洲大蠊(Periplaneta americana Linnaeus) | 安徽 | 2批 |

　　| 金边土鳖 | 金边土鳖(Opisthoplatia orientalis Burm.) | 广东、广西 | 2批 |

　　| 金边龙虱 | 金边龙虱(Cybister tripunctatus) | 安徽 | 2批 |

　　3 方法与结果

　　3.1 DNA提取与质检

　　提取方法考察表明：土鳖虫药材和标准汤剂采用中国专利CN101270357A[23]的方法，配方颗粒采用两步CTAB法[24]，可获得高浓度、高质量的DNA。两种方法提取的DNA经紫外分光光度计检测：

　　饮片和标准汤剂DNA浓度均值分别为543.74 ng·μL⁻¹和255.09 ng·μL⁻¹，A₂₆₀/A₂₈₀分别为1.88和1.89;

　　配方颗粒DNA浓度均值为307.61 ng·μL⁻¹，A₂₆₀/A₂₈₀为1.98。

　　结果表明两种方法适用于土鳖虫饮片、标准汤剂和配方颗粒的DNA提取。

　　3.2 特异性引物设计

　　从Genbank下载地鳖及伪品的COⅠ序列，使用Bioedit、MEGA软件进行ClustalW多重比对。序列对比发现，地鳖在286位的SNP位点为C，而其他物种为A/T。基于该位点，通过Primer Premier 5软件设计鉴别引物：

　　上游引物TBC-F：5’-TTCTTGTTGGCAAGCAGTATAAT-3’

　　下游引物TBC-R：5’-AACTACTGCTCAAACAAATAATGGA-3’

　　PCR扩增产物长度为237bp。

　　3.3 PCR条件建立与优化

　　反应体系(25μL)：10×缓冲液2.5μL，dNTP(2.5 mmol·L⁻¹)2.0μL，鉴别引物(10 μmol·L⁻¹)各0.3μL，DNA聚合酶(5 U·μL⁻¹)0.2μL，DNA模板(标准汤剂和颗粒2.0μL，饮片1.0μL)，高压灭菌超纯水补足至25μL。

　　初始PCR参数：95℃预变性5min;39次循环(95℃30s，55~59℃30s，72℃30s);72℃延伸5min。

　　产物检测：2.5%琼脂糖凝胶(加入GelRed染色剂)电泳，凝胶成像仪观察结果。

　　通过考察聚合酶类型、退火温度、循环次数、酶量、引物量及仪器品牌，确定最佳条件：使用SpeedStar聚合酶，退火温度55~57℃，循环数37次，DNA模板量10~90ng，聚合酶和引物量0.2~0.3μL。该条件下，土鳖虫所有DNA样品均获得清晰扩增条带，伪品无扩增，不同品牌PCR仪扩增结果差异小，空白对照无假阳性，方法耐用性良好(图1)。

　　3.4 检测限考察

　　选择1批土鳖虫配方颗粒，分别稀释20、200、2000、20000、200000、2000000倍，测定DNA模板浓度(表2)，按优化后的PCR体系和条件扩增(图2)。结果显示，DNA浓度1.5~15ng时均出现特异性条带，空白对照无假阳性，故确定检测限(LOD)为1.5ng。

　　表2 土鳖虫配方颗粒稀释浓度

　　| 序号 | 稀释倍数 | DNA浓度/(ng·μL⁻¹) |

　　| 1 | 20 | 15 |

　　| 2 | 200 | 1.5 |

　　| 3 | 2000 | 0.15 |

　　| 4 | 20000 | 0.015 |

　　| 5 | 200000 | 0.0015 |

　　| 6 | 2000000 | 0.00015 |

　　3.5 适用性考察

　　选取21批土鳖虫药材、21批标准汤剂、19批配方颗粒，及美洲大蠊、金边龙虱、金边土鳖的药材和标准汤剂(各2~3批)，按优化条件进行PCR扩增(图3)。结果显示，土鳖虫相关样品鉴定率、真阳性率、真阴性率均为100%，假阳性率和假阴性率均为0，表明该方法可有效鉴别土鳖虫配方颗粒。

　　3.6 测序验证

　　随机选取3批地鳖药材、3批标准汤剂和3批配方颗粒，经PCR扩增后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行Sanger测序。测序结果用SeqMan软件拼接，在NCBI和全球药典基因组数据库(GPGenomeDB)进行BLAST比对(表3)。9批样品与地鳖的相似度为98.0%~100%，证实该特异性PCR方法可用于土鳖虫药材、标准汤剂和配方颗粒的鉴别。

　　表3 土鳖虫样品测序验证结果

　　| 样品 | NCBI比对结果 | 相似度/% | GPGenomeDB比对结果 | 相似度/% |

　　| YC01(药材) | 地鳖(Eupolyphaga sinensis) | 98.86 | 地鳖(Eupolyphaga sinensis) | 99.10 |

　　| YC02(药材) | 地鳖(Eupolyphaga sinensis) | 98.88 | 地鳖(Eupolyphaga sinensis) | 99.03 |

　　| YC03(药材) | 地鳖(Eupolyphaga sinensis) | 98.85 | 地鳖(Eupolyphaga sinensis) | 99.12 |

　　| BZTJ01(标准汤剂) | 地鳖(Eupolyphaga sinensis) | 98.08 | 地鳖(Eupolyphaga sinensis) | 99.37 |

　　| BZTJ02(标准汤剂) | 地鳖(Eupolyphaga sinensis) | 98.91 | 地鳖(Eupolyphaga sinensis) | 100.00 |

　　| BZTJ03(标准汤剂) | 地鳖(Eupolyphaga sinensis) | 98.86 | 地鳖(Eupolyphaga sinensis) | 99.47 |

　　| PFKL01(配方颗粒) | 地鳖(Eupolyphaga sinensis) | 98.82 | 地鳖(Eupolyphaga sinensis) | 99.38 |

　　| PFKL02(配方颗粒) | 地鳖(Eupolyphaga sinensis) | 98.82 | 地鳖(Eupolyphaga sinensis) | 99.26 |

　　| PFKL03(配方颗粒) | 地鳖(Eupolyphaga sinensis) | 98.85 | 地鳖(Eupolyphaga sinensis) | 99.75 |

　　4 讨论

　　中药配方颗粒通过现代工艺将中药饮片提取、分离、浓缩、干燥制粒而成，具有服用方便、安全有效的特点，但传统鉴别方法无法实现原料的准确鉴别，难以保障质量与用药安全。DNA分子鉴别技术为解决这一难题提供了快速有效的手段。

　　模板DNA质量对PCR扩增成功至关重要。本研究比较了专利CN101270357A方法、DNA提取试剂盒法、CTAB法与两步CTAB法：专利方法采用0.5%SDS及蛋白酶K消化，使蛋白质大量降解，DNA溶解于消化液，适用于药材与标准汤剂的DNA提取;配方颗粒生产中添加的蔗糖、麦芽糊精等辅料会干扰DNA提取，两步CTAB法通过降低盐浓度使DNA沉淀，而糖分溶解于溶液，实现DNA与糖分的有效分离，获得纯净DNA模板，满足后续实验需求。

　　中药配方颗粒生产需保证质量均一性，企业通常选择单一基原进行生产。本研究设计的特异性PCR引物针对地鳖基原的土鳖虫配方颗粒，可有效鉴别地鳖与伪品，但未考察药典规定的另一基原(冀地鳖)的适用性。后续将继续开展冀地鳖基原的研究，为完善动物药配方颗粒的分子鉴定提供科学依据。

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